目前，在我国奶牛养殖业中，penicillin和头孢菌素等β-内酰胺类抗生素对奶牛乳房炎等疾病的控制起着十分重要的作用。由于一些奶牛养殖商 户滥用抗生素以及未严格遵守休药期，致使牛奶中抗生素残留超标，乳中残留的抗生素严重危害食品安全和人体健康。我国政府对超过一定限量抗生素的原料乳实施 标准控制。国内多数乳品企业对抗生素残留超标的牛乳采取降价收购或不收购，而一些不法奶站使用一些生物制剂降解牛乳中残留的抗生素，生产出人造"无抗 奶"。
经过调研，初步判断市售生物制剂的主要成分是β-内酰胺酶，它是由革兰氏阳性细菌产生和分泌的多种酶组成的酶家族，相对分子质量在28～32ku之 间，可选择性分解牛奶中残留的β-内酰胺类抗生素。β-内酰胺酶能够破坏penicillin内酰胺结构，使其失去活性。该酶的使用掩盖了牛奶中实际含有 的抗生素。崔生辉等人2007年曾在北京零售超市中采集5个厂家生产的、不同种类的牛奶样品38个，其中63.2%的样品检测出β-内酰胺酶。β-内酰胺 酶为我国禁用的食品添加剂之一，它可导致penicillin、头孢菌素等抗生素类药物耐药性增高，从而大大降低人们抵抗传染病的能力，给消费者的身心健 康带来危害。我国于2009年和2011年公布的食品和饲料中非法添加的非食用物质名单中，β-内酰胺酶（金玉兰酶制剂）两次上榜，且认定的检测方法为液 相色谱法。
原乳中β-内酰胺酶的检测方法有微生物杯碟法、快速试剂盒法、液相色谱法和双流向酶联免疫法。微生物杯碟法成本低廉。试剂盒法和酶联免疫法依据抗原 抗体特异性反应的基本特性，操作简单，速度快，特异性好。液相色谱法具有操作时间短、灵敏度高、准确的特点，但所需实验仪器要求较高。
本研究中制备β-内酰胺酶的多克隆抗体和单克隆抗体，拟通过双抗夹心法为后续的胶体金免疫层析试纸条的研制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
实验动物：日本大耳兔（雌性，两月龄），北京金牧阳实验动物养殖有限责任公司；balb/c小鼠（雌性，spf级，六周龄）、昆明小鼠（18～22g），购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心。
实验试剂：β-内酰胺酶，sigma公司；penicillin酶，中国药品生物制品检定所；牛血清白蛋白（bsa）、脱脂奶粉，北京经日今典科技 有限公司；单组份tmb显色液，北京索莱宝科技有限公司；辣根过氧化酶标记的羊抗兔igg、辣根过氧化酶标记的羊抗鼠igg，北京优博奥生物科技有限公 司；hat、ht、peg2000、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂，sigma公司；小鼠sp2/0细胞，本实验室保存；dmem低糖培养基，gibco 公司；小鼠单克隆抗体亚型试剂盒，洛阳赛尔维实验器材有限公司。
仪器和设备：96孔聚苯乙烯酶标板、细胞培养板，jetbiofil公司；酶联免疫检测仪、凝胶成像仪，bio-rad公司；紫外分光光度计，unico公司。
1.2 免疫抗原的选择
使用sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sds-page）分析β-内酰胺酶和penicillin酶两种蛋白的分子质量及纯度。分离胶10%，积层胶4%，电泳缓冲液为甘氨酸。
1.3 多克隆抗体的制备
使用β-内酰胺酶对3只日本大耳兔进行免疫。对每只大耳兔，取700μgβ-内酰胺酶，用ph7的0.1mol/ltris-hcl稀释至 500μl，与等体积的弗氏完全佐剂混合，充分乳化后于兔子背部皮下和两侧腹股沟多点注射。之后的加强免疫使用同剂量免疫原与等体积的弗氏不完全佐剂充分 乳化，背部皮下多点注射，每次免疫间隔两周。自第3次免疫起，每次免疫4d后于兔子耳缘静脉采血，分离血清，检测免疫效果。五免后3d心脏采血，分离血 清。
1.4 elisa筛选方法的建立
1.4.1 包被原浓度的确定采用方阵法，用系列浓度稀释的penicillin酶横向包被96孔酶标板，将倍比稀释的一抗纵向加入，用间接elisa法确定最佳抗原包被浓度。
1.4.2 包被条件的确定选择4℃overnight，37℃1h，37℃2h3种方式包被，以确定最佳包被条件。
1.4.3 封闭液的选择选择0.2%明胶、5%脱脂奶粉、3%山羊血清、5%小牛血清、0.75%奶粉+2%bsa+5%蔗糖、3%bsa+0.05%吐温+3%蔗糖、5%奶粉+0.05%吐温+3%蔗糖7种封闭液封闭，确定最佳封闭液。
1.4.4 封闭时间的优化封闭时间选择0.5，1，2h，采用间接elisa确定最佳封闭时间。
1.5 单克隆抗体的制备
1.5.1动物免疫将9只雌性balb/c小鼠分为3组，高、中和低3个剂量组每次免疫分别为200，100和50μg/只。首次免疫取相应剂量的 β-内酰胺酶，溶于50μl 0.1mol/l tris-hcl（ph7）中，于等体积的弗氏完全佐剂充分乳化后小鼠后颈背部多点注射。两周后使用同剂量免疫原与弗氏不完全佐剂乳化作第2次免疫，于腹 腔皮下注射。第
3次免疫后，elisa法检测小鼠抗血清的效价。在3组中选取效价最高的小鼠做融合，融合前3d腹腔注射相同剂量的抗原液作加强免疫。
1.5.2 sp2/0骨髓瘤细胞的培养用8-氮杂鸟嘌呤（20μg/ml）处理3代体外培养的sp2/0骨髓瘤细胞，对数生长期时皮下注射balb/c小鼠背部两 侧，每只小鼠注射5×105～1×106个细胞。实体瘤直径长至2～3cm时，无菌解剖摘取，200目的筛网研磨过滤，重新培养至细胞稳定生长。
1.5.3 细胞融合融合前1d使用昆明鼠培养饲养细胞。取对数生长期的sp2/0骨髓瘤细胞与免疫小鼠的脾细胞，用50％peg2000按常规方法融合，使用建立的 penicillin酶间接elisa法检测培养上清。选择强阳性孔，用有限稀释法连续亚克隆4～5次，直至克隆孔100％分泌抗β-内酰胺酶抗体。将建 立的稳定、高效价分泌抗β-内酰胺酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株扩增培养，传3代及冻存复苏后仍能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，然后置液氮中保存。
1.5.4 腹水抗体的制备采用体内诱生法制备腹水。取balb/c小鼠腹腔注射灭菌石蜡油0.5ml/只，两周后注射抗β-内酰胺酶的杂交瘤细胞5×105个/只，1周后收集小鼠腹腔液。
1.6 抗体的特性分析
使用间接elisa法对多克隆抗体和腹水中的单克隆抗体效价进行测定，多克隆抗体以空白血清作阴性对照，单克隆抗体以sp2/0骨髓瘤细胞培养上清 为阴性对照；采用非竞争酶免疫试验对单克隆抗体的亲和力进行测定；使用亚型鉴定试剂盒对杂交瘤细胞株进行亚型鉴定。采用秋水仙素裂解法对杂交瘤细胞株进行 染色体分析。使用westernblotting对单克隆抗体的分子质量和特异性进行测定。
1.7 抗体纯化
1.7.1 多克隆抗体的纯化采用辛酸-饱和硫酸铵法纯化抗β-内酰胺酶的兔血清，2次滴加饱和硫酸铵的最终体积分数分别为50%和40%。将沉淀用少量pbs溶解后转入透析袋中，用pbs溶液透析48h，利用紫外分析法检测透析液直至透析完全。
1.7.2 单克隆抗体的纯化采用peg6000沉淀法纯化balb/c小鼠的腹水，沉淀用50mmol/ltris-hcl溶液（ph8.0）溶解，冰浴除杂蛋白，即得粗提单克隆抗体，用sds-page对抗体纯度进行鉴定。
2 结果与分析
2.1 免疫原
通过sds-page分析β-内酰胺酶和penicillin酶，两种蛋白的分子质量及纯度见图1。两种蛋白在分子质量为30ku处均有明显的蛋白 表达，分子质量数据与预期相符。β-内酰胺酶经sds-page分析，纯度达100%，与说明书一致。penicillin酶经bandscan软件分 析，纯度达61.4%，含有大量杂蛋白。使用纯度较好的β-内酰胺酶作为免疫原。
2.2 兔抗β-内酰胺酶多克隆抗体效价
4免后，3只日本大耳兔的效价分别为1×106，2×106，1×106（见图2）。其中2号大耳兔的效价最高，选取2号大耳兔的血清做elisa的优化实验。
2.3 elisa筛选方法
2.3.1 包被原浓度采用方阵法，用系列浓度稀释的penicillin酶横向包被96孔酶标板，将倍比稀释的一抗纵向加入（用"+"表示），每组加入 50μg/ml的penicillin酶做抑制试验（用"-"表示），使用间接elisa法确定最佳抗原包被浓度。当包被原质量浓度为5μg/ml，兔血 清质量浓度为1∶64000时，od450接近1，且抑制效果最好。使用5μg/mlpenicillin酶作为包被原。
2.3.2 包被条件选择4℃overnight，37℃1h，37℃ 2h 3种方式包被，以确定最佳包被条件。根据p/n的比值，确定4℃overnight为最佳包被浓度。
2.3.3 penicillin酶结构复杂，含杂蛋白。7种封闭液中，使用3%bsa+0.05%吐温+3%蔗糖封闭，特异性最好，封闭效果最佳。
2.3.4 封闭时间采用间接elisa确定最佳封闭时间。当封闭时间2h时，阴性值较低，p/n比值为最大，封闭效果最佳。
2.4单克隆抗体的制备
2.4.1 balb/c小鼠免疫效果从免疫结果看，低剂量组（50μg/只）balb/c小鼠产生抗体的效价最高，达1:128000。同时比较balb/c小鼠的 精神状态，低剂量组较中、高剂量组的balb/c小鼠体态活跃，被毛光亮。使用低剂量组的balb/c小鼠脾脏进行融合。
2.4.2 细胞筛选及亚克隆细胞融合后， 融合率为80%，阳性率为20.5%。经4 次亚克隆，阳性率为100%，筛选出能稳定分泌抗β-内酰胺酶抗体的3株阳性细胞株，分别命名为c1，d1，f8。将f8连续传代3 周及冻存复苏后，检测elisa 效价，结果基本不变，说明所获杂交瘤细胞株稳定。
2.5 抗体特性分析
2.5.1小鼠腹水中单抗效价及亲和力测定结果用间接elisa法检测3株杂交瘤细胞无血清培养基上清效价（1∶32）～（1∶512）。将3株杂 交瘤细胞均腹腔注射获取腹水，3株杂交瘤细胞株中f8腹水的效价最高，选择f8做后续实验。采用非竞争酶免疫试验进行测定。经亲和力常数公式计算，f8的 亲和力为6.4×107l/mol。
2.5.2 3株杂交瘤细胞亚型的鉴定结果使用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒，对筛选出的3株单抗c1，d1，f8进行亚型鉴定，这3株杂交瘤细胞均属于igm 亚型。
2.5.3 f8杂交瘤细胞株染色体的分析 计数100体数目总和基本一致（已知sp2/0细胞染色体数个处于有丝分裂中期的完整f8细胞，染色体数目62～68条，balb/c小鼠脾细胞的染色体数目为96～104条（图7），与sp2/0细胞和脾细胞的染色40条）。
2.5.4 western-blotting检测f8的特异性westernbloting鉴定表明，f8 腹水可与β-内酰胺酶和penicillin酶发生特异性反应（图8），说明f8是针对β-内酰胺酶和penicillin酶的特异性抗体。
2.6 f8杂交瘤细胞株单克隆抗体的纯化
比较了辛酸-冷酒精法、辛酸-饱和硫酸铵法、peg60003种方法，经peg6000方法纯化的单克隆抗体虽然纯度不高，但抗体效价保存最好。
3讨论
金属β-内酰胺酶是一类活性依赖二价金属阳离子的β-内酰胺酶，该酶广泛水解（包括碳青霉烯类、广谱头孢菌素类等）多种β-内酰胺类抗生素，对常用 β-内酰胺酶抑制剂（如克拉维酸、舒巴坦等）不敏感。依据分子生物学，bush于1997年将当时有序列资料的12种金属酶分成3个亚 群：b1，b2，b3。绝大多数金属酶属于b1亚群，该亚群的各种酶分子质量相近（约为28ku），序列一致性大于23%。b2亚群与b1亚群的分子大小 相近，但同源性较低。b3亚群只有9个氨基酸与其它金属酶显著不同，单体分子质量为31.7ku。虽然各亚群金属酶之间的氨基酸序列同源性不高，但是酶蛋 白形成的立体结构却很类似，金属酶中的关键残基，尤其是形成金属键的氨基酸残基高度保守。鉴于β-内酰胺酶的结构特点，选择纯度较好的β-内酰胺酶作为免 疫原。为了使筛选的单克隆抗体能更好地识别β-内酰胺酶，使用中检所的penicillin酶作为包被原。目前，市售β-内酰胺酶检测胶体金试纸条多数采 用的是间接法。间接法是利用β-内酰胺酶酶解penicillin的原理，将牛奶样品与微量penicillin混匀反应。如果牛奶中存在一定浓度的β- 内酰胺酶，那么penicillin经β-内酰胺酶酶解后浓度减少。用试纸条检测penicillin，判断牛奶中是否存在β-内酰胺酶，但是待测样品要 经过多次离心、孵育等工序处理后方可使用试纸条进行检测。而本研究通过研制抗β-内酰胺酶的单克隆抗体和多克隆抗体，使用双抗夹心法，胶体金试纸条直接检 测。该方法的优势是减少反应时间，优化反应步骤。
另外，细菌耐药也能产生内源性β-内酰胺。牛奶中内源性β-内酰胺酶的来源主要有2种途径：一是牛体本身产生的，二是牛本身感染的某些有抗性的微生 物在体内不断分泌表达β-内酰胺酶。目前尚未有能区分产品中所含β-内酰胺酶是人为添加还是耐药细菌产生的报道，这是监管β-内酰胺酶的一个新难题。只有 加强畜牧业、奶业生产全过程管理，提高养殖人员的安全责任心，才是消除抗生素残留，保障牛奶和奶制品安全的根本。