产品名称:副溶血性弧菌pcr检测试剂盒
产品编号:btn29088
产品规格:50t
产品保存:-20℃
pcr反应的影响因素:
退 火温度与时间:退火温度决定pcr特异性与产量。温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，dna扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物 与模板错配，非特异性产物增加。合适的退火温度一般在45~68℃之间。设置特定反应的最适退火温度，可根据引物的（g+c）%含量进行推测，一般实验中 退火温度比扩增引物的熔解温度tm低5℃，退火时间一般为30~60秒，足以使引往返与模板之间完全结合，长时间退火没有必要。
引 物:引物与模板配对的长度应到少为17个核苷酸，最高不宜超过30个核苷酸，最佳长度为20~24个核苷酸，如需插入酶切位点，应在酶切位点5’端多加几 个碱基，有利于酶切。引物的（g+c）%含量组成应均匀，尽量避免含有相同的碱基多聚体。两个引物中（g+c）%含量应尽量相似。引物内部应避免形成明显 的次级结构，如发夹结构。两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3’端。如果可能，引物3’端最好富有gc，这样退火后有利于引物3’端的延伸。人工合 成的引物最好经验丰富色谱层析或page纯化，以除去未能合成至全长的短链等杂质。引物的终尝试一般为0.1-2 μm左右，尝试太高会导致非特异性扩增，太低则扩增产物太少。
酶量:50 μl反应体系可用0.5-5 u酶，酶量的选择与模板dna的量，扩增片段大小等有关，酶量过多易发生非特异性反应，而且可能增加突变的机率，尤其在进行高保真扩增时，应尽量减少酶量，但酶量过少时反应性能下降。
模 板:模板可以是单链dna，也可以是双链dna，质粒dna的扩增效率略低于线状dna。模板加量一般不需太多，不超过1 μg为宜，因为加量过多可能导致非特异性扩增增加，但是要考虑模板中靶序列的含量。例如，使用基因组为模板扩增单拷贝或低拷贝靶序列，就需要适当加大模板 用量。
变 性温度与时间:模板变性温度是决定pcr反应中双链dna解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链dna模板，pcr也就不会启动。变性温度低则变性不 完全，dna双链会很快复性，因而减少产量。变性温度太高，又会影响酶的活性。一般情况下可设为94℃ 20~30秒，高温时间应昼缩短，以保持耐热dna聚合酶的活力，最高变性温度不宜超过95℃。
延 伸温度与时间:pcr反应的延伸温度一般选择在70~75℃之间，延伸时间根据所用聚合酶扩增速度和扩增片段大小设定，如同样扩增2 kb片段，若使用taq酶只需1分钟，使用pfu酶则应设定2分钟以上。延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现，时间太短则可能得不到扩增产物或得到一 些短的非特异性片段。
循环次数:可根据模板dna的量、扩增片段的大小和扩增产物的下步应用等因互，设定20-40个循环。循环次数太少，扩增量不足，如果循环次数太多，错配几率会增加，非特异性背景严重。所以，在保证产物得率前提下，应尽量减少循环次数。