一、荧光基础知识
在显微成像中，荧光指的是一种光致发光现象，某些分子能吸收特定波长的光线，然后再发射出其他波长的光线的物理现象，这种分子一般称为荧光团。通常情况下，由于斯托克斯位移，荧光团的激发峰值和发射光谱之间存在差值，发射光线能量低于吸收光线，波长比激发光更长。
荧光现象有两种：自发荧光与继发荧光。自发荧光也称固有荧光，是指经照射后就能发出荧光；继发荧光也称二次荧光，物质经照射后不能或只能部分发生微弱荧光，需先用荧光染料标记处理，再经照射才能发生荧光。目前在荧光显微技术中，主要利用的是继发荧光现象。
念珠藻叶绿体的自发荧光，明美MF52-N拍摄
荧光产生包含激发和发射两个过程，在荧光显微技术中具体体现为以下几个关键部件：
（1）激发光源：主要包含以下两个指标
Ø 光源光谱覆盖发射光谱：荧光团在特定波段范围才能被大部分激发，因此激发光源的光谱范围要能匹配所观察样本中的荧光团激发特征。
Ø 发射光谱波段的强度：荧光信号一般较弱，需要使用较高亮度的激发光以产生较强信号的发射荧光信号。
（明美-四通道LED光源MG120，宽光谱 + 高光功）
（2）激发块：用于形成特异性激发/发射的一组滤光片，一般包含以下三个
Ø 激发滤光片EX：滤过光源中特定波段的光，用以激发样本中特定染料
Ø 发射滤光片EM：允许荧光团发射的特定波段的光通过
Ø 二向分色镜DM：反射激发波段的光，透过发射波段的光。透射荧光显微镜没有这个滤光片，但目前主流都是落射荧光显微镜，会有二向分光镜。
（明美可定制适配四***，不同波段需求的激发块）
二、荧光显微成像的应用
荧光显微镜利用自发荧光或继发荧光现象，广泛用于生物（医学）、矿物、材料科学等领域的显微荧光观测。①在生物学领域，主要借助荧光染料标记，可准确和详细地识别细胞和亚微观细胞成分。②在矿物学领域，通常用于研究有自发荧光特性的物质，如石油、煤炭、氧化石墨烯等矿物。③在材料科学，可用于纺织工业或造纸业来分析基于纤维的材料，包括纺织品和纸张，在半导体领域，也可用来观测具有荧光特性的材料如磁珠等。
明美MF31-LED荧光显微镜观察SBS改性沥青
（MF43-N拍摄的磁珠荧光图片）
荧光显微技术在生物学领域中应用是广泛也是复杂的，主要是对细菌、细胞、组织或小型生物（如斑马鱼等模式生物）进行标记成像，它的微观层面都是通过荧光染料对分子层面进行标记。从荧光染料的选择看，通常需要考虑几个因素，一是荧光染料标记的位置，二是该染料对应的激发特征，包括吸收光谱特征和发射光谱特征。借助荧光染料，荧光显微技术不只局限于蛋白质，它还可以对核酸、聚糖进行染色，甚至钙离子等非生物物质也可以检测。以下根据染料结合的位置列举了一些常见的荧光染料及应用范围：
FITC荧光染色，MF52-N拍摄
（1）免疫荧光（IF）：主要标记的是蛋白质。免疫荧光技术利用抗体可以和相应抗原特异性结合的特性，主要有两种方式：一是利用内源荧光信号，即通过克隆技术用遗传学方法将荧光蛋白与目的蛋白相连，如GFP等；二是利用荧光标记的抗体与目的蛋白特异性结合。
Ø FITC（异硫氰酸荧光素）：是一种有机荧光染料，495/517 nm为该染料激发/发射峰值，可以和蛋白质上的基团结合，主要用于免疫荧光和流式细胞术中。
Ø TRITC（四甲基罗丹明-5(6)-异硫氰酸）：属于罗丹明家族的衍生物，550/573 nm为该染料激发/发射峰值，可与蛋白质结合。
Ø 花箐染料（cy3、cy3.5、cy5、cy5.5、cy7等系列）：非特异性吸附少，消光系数高，荧光产率高，从而让标记显影时背景弱，信号强。除细胞显影外，它们也常用于生物筛选、蛋白免疫印迹、生物医学显影、小动物体内成像等。
Ø Alexa Fluor系列：属于带负电荷且亲水的荧光染料系列，是不同基础荧光物质的磺化形式。这些产品标识涵盖了对应的激发波长，相比于FITC等染料，具有更好的稳定性和荧光亮度。
DAPI荧光染色，MF52-N拍摄
（2）DNA染色：主要标记核酸。同蛋白质一样，对核酸进行标记与研究同样有重要意义，如对细胞核（主要成分为核酸）进行染色标记可以判断细胞的数量和位置。
Ø DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）：当DAPI与双股DNA结合时，在358nm处有一个吸收峰值，在461nm处有一个发射峰值，其发射光的波长范围含盖了蓝色至青绿色。DAPI也可与RNA结合，但产生的荧光强度不及与DNA结合的结果。DAPI可以透过完整的细胞膜，因此被广泛用于活细胞和固定细胞的染色。
Ø Hoechst（33258、33342、34580）：这三种染料都可在350nm左右的紫外光激发，在461nm处发出蓝靛色荧光。与DAPI类似，Hoechst可透过完整细胞膜，被广泛用于活细胞和固定细胞染色。
Ø PI（碘化丙啶）：是一种不能透过细胞膜的DNA染色剂。与核酸结合后，激发波长为538 nm，发射波长为617 nm。由于该染色剂无法进入完整的细胞中，因此该染色剂常用于区分细胞群中的活细胞和死细胞。
Fura2钙离子探针做的研究图片， 引自公开文献
Front. Neural Circuits 11:11. doi: 10.3389/fncir.2017.00011
（3）离子成像：研究细胞中各种离子的流动与分布对细胞活动的深入理解有重要作用。通过各种离子指示剂，如钙离子、钠离子、镁离子、锌离子等指示剂与离子结合形成荧光团，利用光谱特征检测对应离子的分布状态。
三、荧光显微成像的挑战
应用荧光显微技术进行成像的过程中，不仅要考虑成像的质量，包括分辨率、对比度、荧光信号强弱、背景光、多通道成像等，还要考虑荧光染料、光照等对样本的影响，比如荧光染料毒性、光毒性、光漂白等。以下列出了荧光显微技术应用中的常见挑战与应对方法：
汞灯需搭配带计时器的复杂控制箱来使用
（1）激发光源选择和使用。传统荧光成像使用的是高压汞灯，具有特异性的光谱特征和较高的光强，但使用有很多麻烦，首先需要预热，然后光强靠ND滤镜调节，寿命较短可能就200小时，在寿命用完前还会有光强衰减问题，需要调整ND滤镜，替换灯泡后需要重新校中。目前很多应用都用LED荧光光源取代汞灯作为荧光光源，如宽光谱大功率LED荧光光源MG-100，寿命长单个可以顶50个汞灯，光强更稳定可控，并且可以即开即用，省事省心。
明美可定制适配四***的滤光片组
（2）滤光片质量和匹配度。激发块中的滤光片质量会影响激发光和发射光的透过率，影响荧光效率并带来杂散光和背景噪声问题。同时，滤光片的参数能否匹配染料的激发峰和发射峰，也会对荧光效果产生重大影响。对于简易荧光需求，明美建议使用数显荧光模块，整合光源和BGU等常用激发块，可以为四***显微镜升级荧光观察，简单易用效果好。对于专业荧光需求，明美提供匹配四***主流荧光显微镜的激发盒和滤光片组，可按需定制不同滤光片组合，如钙离子Fura2探针需要用U激发G发射，一般的U激发B发射滤光片组并不适合。
（MF43-N+MC50-S拍摄的小鼠脑片荧光图像）
（3）光毒性与荧光染料毒性：在生物学领域的荧光成像中，需考虑光毒性与荧光染料毒性对样本的影响，如细胞内的有机分子在与氧反应时吸收光发生分解并产生自由基，部分荧光染料本身也能产生自由基，这是引起细胞等生物样本损伤的主要来源。通常的应对思路是：①使用具有较低能量（波长较长）激发光谱的荧光染料；②尽可能低的光强和尽可能短的激发时间，需要在成像质量与样本健康之间保持平衡；③降低帧速率，尤其在长时间的荧光成像中，这种情况需要提高相机的灵敏度，保证捕获微弱的荧光信号。
（单通道荧光拍摄，经软件合成多色荧光图像）
（4）多色荧光成像：在生物学领域应用较多，尤其是在对活细胞标记成像时，需同时对多种物质进行标记，并在一个图像中显示，而大多数荧光染料具有宽发射光谱，在使用多种染料标记时会出现荧光光谱重叠现象。对于多色荧光成像，有两种应对思路，一是针对每种染料使用对应的单通道窄带滤光片，后通过软件进行合成，这种方式对成像速度及软件图像处理提出较高要求；二是使用宽光谱光源同时激发，选用双通滤光片或多通滤光片，这种滤光片的的特点是允许两种或以上波段荧光信号通过，可实现一组滤光片同时观察两种或以上荧光染料，这种方式要求相邻的发射光谱范围没有重叠，所得到的荧光信号之间能较好的被区分。
（双通滤光片荧光拍摄，镜下可同时观察到B\G两种荧光信号）
来源：https://www.mshot.com/article/1527.html