一种微生物絮凝剂的研制

一种微生物絮凝剂的研制 周娟 (上海电力学院能源与环境工程学院,上海　200090) 摘要:从活性污泥中筛选得到一种产生高絮凝活性的菌株,经过培养条件优化,可提高絮凝效果.对乙醇法、丙酮法和ctab法3种提取方法进行比较,确定其最优化条件为:培养基初始ph7.5,培养时间66h,培养温度30℃,160r/min.最优条件下,以ctab提取法得到絮凝剂的絮凝活性达71.8%,且无需添加cacl2助凝剂,产率为1.33g/l. 关键词:微生物絮凝剂;提取方法;絮凝活性 中图分类号:x172　　文献标识码:a 文章编号:1674-2974(2009)07-0073-04 微生物絮凝剂是微生物在特定培养条件下,生长代谢至一定阶段产生的具有絮凝活性的胞外代谢产物,主要成分为糖蛋白、多糖、蛋白质、dna等[1-3].20世纪80年代后期,日本的仓根隆一郎筛选出红平红球菌s-1(rerythropoliss-1)菌株,将由该菌株产生的微生物絮凝剂命名为noc-1,是目前为止发现的絮凝效果最好的微生物絮凝剂,对多种废水均具有良好的絮凝除浊效果[4-5].微生物絮凝剂与传统的化学絮凝剂不同,不仅具有良好的絮凝沉淀性能,且安全,无毒,可生物降解,对生态环境也不产生不利影响;同时,能生产絮凝剂的微生物种类多,生长快,易于采取生物工程手段实现产业化[6-8],因而具有广阔的发展前景. 目前,微生物絮凝剂应用的最大障碍是用量大、成本高,所以筛选高效微生物絮凝剂产生菌,提高絮凝活性,降低絮凝剂用量与成本,是微生物絮凝剂能否推广应用的关键.本研究从城市污水处理厂的活性污泥中筛选出一种高产絮凝剂菌株,并对絮凝剂的研制条件进行优化考察,如确定最佳的培养时间、ph、投加量、提取方法等,以提高絮凝活性和降低微生物絮凝剂的生产成本. 1　材料与方法 1·1　菌种来源与培养基菌种来源于上海杨浦区东区污水厂曝气池活性污泥. 基础培养基:牛肉膏蛋白胨培养基筛选培养基(葡萄糖培养基):将葡萄糖20g,kh2po40.2g,k2hpo40.5g,(nh4)2so40.2g,nacl0.1g,脲0.5g,酵母膏0.5g,mgso4·7h2o0.2g,(2%琼脂)加入到1000ml水中,调ph为7.0,112℃灭菌30min. 1·2　菌种筛选方法 活性污泥稀释后,置30℃恒温摇床,160r/min富集培养3d,采用稀释平板涂布法获得单菌落,纯化后编号.再分别将纯化后菌株接入100ml筛选培养基中,30℃,160r/min摇瓶培养3d,所得培养液进行絮凝活性的初步测定,絮凝活性较高者即为产絮凝剂菌株. 絮凝活性测定:称取0.1g高岭土,加入蒸馏水至200ml,制成高岭土悬液;取2ml待测液加入到200ml高岭土悬液中,慢速搅拌10min,静置5min,在550nm处测上清液吸光度b,以去离子水代替待测液作为对照,同法测吸光度a.絮凝率=(a-b)/a·100%. 1·3　有效絮凝成分分布实验 将培养液3000r/min离心20min,分别比较培养液、离心后上清液、离心后菌悬液的絮凝率. 1·4　培养条件优化 将菌种种子培养后再进行摇瓶培养,分别对培养基初始ph和培养时间对絮凝率的影响进行测定. 1·5　絮凝剂的提取 1.5.1　丙酮法[8] 培养液离心分离(5000r/min,离心25min),去除沉淀(菌体和杂物);上清夜中加入1.5倍体积的丙酮,4℃放置过夜;12000r/min,离心10min,去除上清液;乙醚洗涤沉淀;真空干燥,得到絮凝剂粗制品. 1.5.2　乙醇法[2] 培养液离心分离(5000r/min,离心25min),去除沉淀(菌体和杂物);上清夜中加入1.5倍体积预冷的无水乙醇,混匀,离心,收集沉淀;70%乙醇洗涤沉淀;真空干燥,得到絮凝剂粗制品. 1.5.3　十六烷基三甲基溴化铵(ctab)法[6]培养液离心分离(5000r/min,离心25min),去除沉淀(菌体和杂物);上清夜中缓慢加入浓度为10%的ctab,直到无沉淀析出;离心,收集沉淀;将沉淀溶于2mol/l的nacl溶液中,加2~4倍体积的无水乙醇进行沉淀(直到无沉淀析出);分别用75%乙醇、无水乙醇、乙醚进行洗涤;真空干燥,得到絮凝剂粗制品. 2　结果与讨论 2·1　菌种筛选 通过对活性污泥的筛选,本实验筛选到1株絮凝活性较高的菌株,其培养物的絮凝活性达44.7%. 2·2　有效絮凝成分分布实验 图1显示培养物的有效絮凝成分主要集中在上清液中,菌悬液几乎没有絮凝活性,因此,在以下的实验中,絮凝活性的测定均取培养物的上清液. 2·3　培养基初始ph对絮凝活性的影响 分别配制ph6.0,ph6.5,ph7.0,ph7.5,ph8.0,ph8.5和ph9.0的葡萄糖培养基,摇瓶培养3d,测絮凝率结果见图2.由图2可见,该菌株适合在ph偏中性条件下生长和合成絮凝物质,在ph7.5时,絮凝率最大.在酸性条件下,如ph6.0时,絮凝率仅为32.2%.碱性条件下同样也不利于絮凝剂的产生,如在ph9.0时,絮凝率仅为36.0%.由图2得出,该菌株适宜生长的ph为7.0~7.5,ph7.5时絮凝率最大,因此,在后续实验中,培养基初始ph定为7.5. 2·4　培养时间对絮凝活性的影响 将筛选后的菌种进行摇瓶培养,在培养时间分别为22h,44h,66h,88h时,测其絮凝率结果见图3.由图3可见,在培养时间为0~22h,微生物生长迅速,代谢旺盛,培养物絮凝活性随培养时间增加提高;22~66h絮凝率略有升高,但变化不大,在培养66h时絮凝率最高;66h后由于微生物生长代谢的消耗,培养液的絮凝率开始降低.因此,本实验培养时间设定为66h. 2·5　投加量对絮凝率的影响 分别测定絮凝剂投加量体积分数为0.75%,1%,1.25%和1.5%时的絮凝率,结果见图4.由图4可知:上清液投加量在1.00%~1.25%时絮凝效果最好,达到59.5%.小于或大于此范围时,絮凝效果均有所降低. 2·6　提取方法对絮凝剂粗品絮凝活性的影响 在絮凝剂粗制品的投加量均为3mg/l的情况下,分别对丙酮提取法,乙醇提取法和ctab提取法得到的絮凝剂粗品进行絮凝率的测定,絮凝率结果依次为66.0%,67.4%和71.8%.3种方法得到的粗制品絮凝活性相差不大,ctab法得到絮凝剂的絮凝活性相对较高. 2·7　提取方法对絮凝剂粗品产率的影响 由图5可见,丙酮提取法,乙醇提取法和ctab3种提取法中,ctab提取法得到的絮凝剂的产率最高,达1.33g/l. 3·结　论 1)以污水厂曝气池活性污泥为菌源,通过富集培养,初步筛选出能产生絮凝剂的活性菌株;该菌株较适的培养基初始ph为7.0~7.5,30℃下,160r/min摇瓶培养66h; 2)通过对丙酮提取法,乙醇提取法和ctab提取法3种提取方法的比较表明,ctab法具有较高的产率,每升培养液可得到1.33g的干制品,3种方法得到的粗制品絮凝活性相差不大,ctab法相对较高,为71.8%. 3)本研究从微生物培养液中提取得到的絮凝剂产率高,具有较高的絮凝活性,且对环境不会造成二次污染,具有非常广阔的应用前景. 参考文献 [1]李焱.微生物絮凝剂的制备及效果实验[j].环境科学与管理,2007,32(5):114-117. [2]何宁,李寅,陈坚,等.一种新型蛋白聚糖类生物絮凝剂的分离纯化及组成分析[j].化工学报,2002,53(10):1022-1027. [3]黄民生,沈荣辉,夏觉,等.微生物絮凝剂研制和废水净化研究[j].上海大学学报:自然科学版,2001,7(3):214-218. [4]王镇,王孔星,谢裕敏,等.几株絮凝剂产生菌的特性研究[j].微生物学通报,1995,35(2):121-129. [5]吴焕利,冯贵颖,赵淑艳,等.微生物絮凝剂的制备及其絮凝活性[j].环境污染与防治,2007,29(11):858-861. [6]栾兴社,张长铠,董晓红.微生物絮凝剂生产的下游条件及制品的毒理特性研究[j].化工科技,2005,13(4):9-13. [7]甘莉,孟召平,常志华,等.絮凝剂产生菌的研究新进展[j].化学与生物工程,2005,(5):4-6. [8]叶晶箐,谭天伟.微生物絮凝剂的研制———菌种选育、絮凝效果及提取工艺[j].微生物学通报,2001,28(4):31-35.