金钗石斛生物碱和水溶性多糖的累积规律
来源：中国论文下载中心 [ 11-04-24 10:31:00 ] 编辑：studa20
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作者：杨立昌，项君，洪鲲，乙引，王亚筑，林俊清
【摘要】 目的探索金钗石斛体内生物碱和水溶性多糖累积规律。方法生物碱、水溶性多糖分别采用氯仿、乙醇提取并测定其吸光度。结果生物碱含量以思茅产最高，罗甸产最低，岩生基质高于树生基质，野外栽培和温室载培对金钗石斛生物碱含量无影响;水溶性多糖含量以赤水产最高，合江产最低，树生基质高于岩生基质，野外栽培高于温室栽培。结论不同产地、不同生长条件下金钗石斛生物碱和水溶性多糖累积规律存在差异。
【关键词】 金钗石斛; 生物碱; 水溶性多糖; 累积
金釵石斛是我国重要的传统中药材，具有抗肿瘤、增强机体免疫能力，扩张血管、抗氧化等药效，其药用价值历代为人们所推崇。金钗石斛是《中国药典》(2000年版)[1]中规定的石斛原植物,也是石斛药材中的主流种类，其有效成分主要有生物碱和多糖，前者具有镇痛解热作用，可降低心率、血压，减慢呼吸，可产生中度的高血糖，具强壮作用并可解巴比妥中毒，后者可增强机体免疫功能[2]。
贵州赤水是金钗石斛的原产地之一，已有百余年的传统栽培历史。随着中药现代化的开展，金钗石斛已成为贵州省开展GAP规范化种植的主要药材品种。目前，由于对金钗石斛有效成分积累规律缺乏认识，在各个种植基地均普遍存在种源混乱、盲目栽种和随意收割等问题，未能有效发挥金钗石斛的药用价值，产品质量得不到保证。因此，本文试图通过对不同地域、不同生境、不同发育期金钗石斛体内生物碱和水溶性多糖积累的研究，为贵州省金钗石斛的GAP规范化种植提供科学数据。
1 材料与仪器
1.1 材料金钗石斛采自贵州赤水，用于对比的金钗石斛来自四川合江、云南思茅和贵州罗甸。
1.2 仪器BP61S型电子天平(德国Satoris公司，精确度0.001g);7551型紫外可见分光光度计(惠普上海分析仪器有限公司);电子恒温水浴锅(深圳市沙头角国华仪器厂);加样枪(10，20，100，200，1 000 μl)(法国Gilson公司);恒温烘箱;索氏提取器;回流装置;干燥器;pH计等。
2 方法
2.1 样品制备取金钗石斛鲜品，105℃杀青30 min，60℃烘干至恒重，粉碎，过60目筛。
2.2 生物碱含量测定参照金蓉鸾等[3]的方法。准确称取粗粉0.500 g ，置于150 ml磨口平底烧瓶中，用5 ml氨水湿润，密塞放置30 min，加氯仿10.0 ml，称重，置80℃水浴锅上回流提取2 h，冷却后称重，补充氯仿至原重，过滤。精确量取滤液1.0 ml，用氯仿稀释至25 ml，摇匀，取10 ml于60 ml分液漏斗中，加入pH4.5缓冲液5.0 ml和0.04%溴甲酚绿1.0 ml，剧烈振摇3 min，静置30 min，氯仿层用氯仿浸泡处理并干燥后的药棉过滤，取滤液6.0 ml，加入0.01 mol/L NaOH的无水乙醇液1.0 ml，摇匀。于波长620 nm处测得吸收度。以石斛碱作为内标绘制标准曲线。总生物碱含量(以石斛碱计，%)=(样品液吸收度×20 μg×稀释倍数)/(标准品吸收度×样品重)×100%。
2.3 水溶性多糖含量测定参照李满飞[4]、李合生[5]和陈毓荃[6]等的方法。称取金钗石斛粗粉0.100 g，在索氏抽取器中用80%乙醇于78℃水浴锅上回流提取3 h。将装有样品的滤纸包于105℃烘干，加40 ml重蒸水，沸水浴提取3 h，趁热过滤，收集滤液。合并滤液，定容至1 000 ml。精密吸取样液1 ml，加苯酚试液0.5 ml，摇匀，迅速滴加浓硫酸2.5 ml，摇匀，静置5 min，沸水浴15 min，迅速冷却至室温，于490 nm处测定吸光度。以葡萄糖作为标准绘制标准曲线。多糖的含量(%)=[(从标准曲线查得糖的含量/ 测定用样品液的体积)×提取液体积×稀释倍数/样品重量×106]×100%。
2.4 统计分析将所得数据经EXCEL2003和SPSS15.0进行统计分析。
3 结果
3.1 产地对金钗石斛有效成分累积的影响不同地区生物碱和水溶性多糖含量因立地条件、气候的不同而有差异(表1)。结果显示，思茅产金钗石斛的生物碱含量最高，其干重和鲜重百分含量分别为0.510 0%和0.086 3%;罗甸产金钗石斛生物碱含量最低，其干重和鲜重中生物碱含量分别为0.266 7%和0.043 0 %。由方差分析可看出，如果以干重计算，罗甸产金钗石斛的生物碱含量与赤水、合江、思茅产金钗石斛生物碱含量存在极显著差异;如果以鲜重计算，则罗甸产与思茅产金钗石斛之间存在显著差异。表1 不同产地金钗石斛生物碱、水溶性多糖含量
3.2 附生基质对金钗石斛有效成分累积的影响以贵州赤水产金钗石斛为实验材料，研究了附生于岩石和树干上的金钗石斛体内生物碱和水溶性多糖累积的影响(表2)。方差分析结果显示，虽然附生基质不影响金钗石斛体内生物碱的单位鲜重含量(F=4.200)，但是，却极显著影响生物碱的单位干重含量(F=52.364)。以干重计算，附生岩石和附生树上金钗石斛的生物碱百分干重分别为0.486 7%和0.406 7%，前者为后者的1.2倍。同样，方差分析表明附生基质对金钗石斛体内水溶性多糖的累积过程没有显著影响。表2 附生基质对金钗石斛有效成分累积的影响
3.3 栽培环境对金钗石斛有效成分累积的影响在温室中驯化栽培与野外栽培相比，前者具有方便、成本低、利于控制石斛生长条件的优势。但两种栽培环境下的有效成分含量才是决定何者更为科学，更有利于提高药用价值的标准。以贵州赤水产金钗石斛为实验材料，研究了野外栽培和温室栽培过程中的金钗石斛体内生物碱和水溶性多糖的累积(表3)。结果表明，栽培环境显著影响水溶性多糖含量，但对生物碱累积没有显著影响。特别是以干重计算，野外和温室栽培条件下金钗石斛水溶性多糖含量分别为2.325 0%和2.106 7%，前者为后者的1.1%，存在极显著差异(F=42.735)。表3 栽培环境对金钗石斛有效成分累积的影响
3.4 生长期对金钗石斛有效成分累积的影响不同生长期对赤水金钗石斛中的生物碱和水溶性多糖累积的影响见图1。结果显示，随着生长期的延长，生物碱逐渐积累，在3月龄金钗石斛体内生物碱含量只有0.09%，但在3年龄金钗石斛体内生物碱含量达到0.53%，两者相差5.9倍。相反，金钗石斛体内水溶性多糖累积出现先增加后降低的趋势，在第1年基本达到饱和，在第2年达2.83%为最高值，但在3年龄金钗石斛体内水溶性多糖含量则降低到2.25%。
4 讨论
生物碱和水溶性多糖是药材石斛的主要有效成分，它们在金钗石斛体内含量的高低直接影响到药材质量，因此，本文研究对于金钗石斛产地选择和规范化种植具有现实的指导意义。我们的研究表明，金钗石斛生物碱含量顺序为云南思茅>贵州赤水>四川合江>贵州罗甸，而水溶性多糖含量则为贵州赤水>云南思茅>贵州罗甸>四川合江(表1)，由此可见，赤水是贵州金钗石斛理想的生产地。贵州赤水、云南思茅产金钗石斛有效成分含量的差异，可能与生长区的气候条件、光照、水分等的差异有关。图1 生长期对金钗石斛有效成分积累的影响
在贵州赤水，金钗石斛喜生于岩石或林中树干上[7,8]，因此，我们研究了附生于岩石和树干上金钗石斛的有效成分，发现附生于岩石上的金钗石斛其生物碱含量明显高于附生于树干上的植株，但是水溶性多糖含量则无明显差异(表2)。与树干相比，岩石表面土壤层有机质极度匮乏，水分短缺，温差变化大，由此猜想金钗石斛生物碱的累积是否与其抵抗逆境的生理响应有关。但是，野外栽培和温室栽培试验结果表明，不断变化的野外环境条件并没有刺激或诱导生物碱累积(表3)。在对不同生长期金钗石斛有效成分的研究中，发现无论是生物碱还是可溶性多糖，其含量均在生长的第一年出现较大增长，以后出现缓慢增长或下降(表4)，推测金钗石斛有效成分的累积可能受植物发育过程的调控。
【参考文献】
[1] 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部[S].北京：化学工业出版社，2000.
[2] 贵州中药资源普查办公室、贵州省中药研究所.贵州中药资源[M]. 北京：中国医药科技出版社,1992.
[3] 金蓉鸾，孙继军，张远名.11 种石斛的总生物碱测定[J].南京药学院学报，1981，1：
[4] 李满飞，徐国钧，平田义正，等.中药石斛类多糖的含量测定[J].中草药，1990，21(10)： [5] 李合生.植物生理生化实验原理和技术[M].北京：高等教育出版社，2000.
[6] 陈毓荃.生物化学实验方法与技术[M].北京：科学出版社，2002.
[7] 何涛，淳泽，罗傲雪，等.四川石斛野生资源及其保护研究[J].应用与环境生物学报，2008，14 ( 5 ): 710.
[8] 蒋波，詹源庆，黄捷.金钗石斛濒危原因及其野生资源保护[J].中国野生植物资源。