细胞毒性试验MTT法，又称MTT比色法，是一种广泛使用的检测细胞存活和生长的方法，尤其适用于评估药物或新型材料对细胞的毒性影响。以下是对MTT法的详细解析：
一、MTT法的基本原理
MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）是一种黄色或橙黄色的粉末状化学试剂，难溶于水，但易溶于DMSO（二甲基亚砜）。其检测原理基于活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能将外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan），并沉积在活细胞中，而死细胞则无此功能。随后，DMSO能溶解细胞中的甲瓒，通过酶标仪在特定波长（通常为490nm或570nm）处测定其光吸收值（OD值），从而间接反映活细胞的数量和活性。
二、MTT法的实验步骤
细胞培养：将细胞种植在96孔板中，并允许其附着生长至适宜的密度。
添加处理物：向孔中加入待测的化合物、药物或其他样品溶液，设置不同浓度梯度以观察剂量效应。
MTT孵育：在一定时间后（如细胞单层铺满孔底后），向孔中加入MTT溶液，继续孵育一段时间（通常为4小时）。
溶解甲瓒：小心去除培养液，用PBS冲洗后，加入DMSO或其他溶剂溶解甲瓒结晶。
吸光度测量：使用酶标仪测定各孔中的吸光度（OD值），通常在490nm或570nm波长处。
数据分析：通过比较处理组和对照组的OD值，计算细胞活力百分比，评估细胞毒性。
三、MTT法的注意事项
DMSO的使用：DMSO虽然能迅速溶解甲瓒，但其对人体毒性较大，且需去除原培养液，过程中可能带走部分结晶，影响结果稳定性。因此，操作时需小心谨慎。
血清干扰：高浓度血清会影响吸光度值，因此需避免血清干扰。
细胞接种密度与培养时间：需选择适当的细胞接种密度和培养时间，以保证实验结果的准确性。细胞数太多可能导致敏感性降低，太少则可能观察不到差异。
MTT的保存与配制：MTT需现用现配，过滤后在4℃避光保存两周，-20℃长期保存。避免反复冻融和长时间保存导致的MTT失效。
MTT的致癌性：MTT具有致癌性，使用时需小心谨慎，遵循实验室安全规范。
设置调零孔和对照孔：实验时需同时设置调零孔（仅含培养基、MTT和DMSO）和对照孔（含细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT和DMSO），以排除非特异性因素的影响。
四、MTT法的应用
MTT法已广泛用于生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等领域。其优点是灵敏度高、经济实用，但操作相对复杂且耗时较长。在评估药物或材料对细胞的毒性影响时，MTT法是一种重要的体外细胞功能检测方法。