实验原理
tp53是重要的抑癌基因。在多种肿瘤中都能发现tp53基因突变及功能丧失。我们将针对tp53基因设计的靶点构建到pcas9/grna1载体，转染293t细胞，构建了tp53基因敲除293t细胞系。
1、本实验基因敲除原理：pcas9/grna1载体表达grna和cas9蛋白。将靶点序列克隆到pcas9/grna1载体上，grna将诱导cas9蛋白对靶点dna进行切割，造成dna断裂。细胞通过邻端连接( nonhomologous end-joining)修复重新连接dna，造成靶点附近dna序列缺失突变。
cas9切割原理:
2、ptyne载体靶点验证原理：将包括靶点在内的大约200bp基因组序列克隆到ptyne载体。构建好的ptyne载体与pcas9/grna1基因敲除载体共转染293t细胞。如果靶点有效，基因敲除载体对ptyne载体载体切割，经过细胞修复后ptyne上移码突变的egfp基因得到修复，发出绿色荧光。
3、阳性细胞筛选原理：pcas9/grna1载体本身不带筛选标签。我们用带有嘌呤霉素和egfp标签的载体plv-egfp（2a)puro和pcas9/grna1载体共转染，再用嘌呤霉素筛选转染成功的细胞。
简要步骤
设计靶点→构建pcas9/grna1载体→ptyne验证靶点→pcas9/grna1载体转染293t细胞→挑选培养细胞克隆→测序验证基因敲除
靶点设计和基因敲除载体构建
人tp53基因有多个mrna和蛋白拷贝，2个转录起始位点，以及多个翻译位点。我们在tp53基因的第四外显子设计了2个crispr基因敲除靶点，以实现对所有tp53蛋白的编辑。
靶点序列1：acctgccctgtgcagctgt
靶点序列2：ttgattccacacccccgcc
将靶点1和靶点2构建到pcas9/grna1载体，获得针对tp53基因的grna基因敲除载体pcas9/grna1-p531和pcas9/grna1-p532。构建方法同pcas9/grna1使用说明中的方法。
靶点验证
1、ptyne-53验证载体构建
为了验证基因敲除靶点的效率，我们把tp53第四外显子部分序列通过xhoi、hindiii酶切位点连接到ptyne载体，通过ptyne载体验证靶点的切割效率。构建完成的载体命名为ptyne-53。
构建完成后ptyne-53载体序列：
注： 黄色：cmv promoter；灰色：tp53第四外显子部分序列；绿色：egfp序列；下划线：crispr靶点
2、用ptyne-53验证靶点
1) 转染前24小时将293t铺到24孔板中。同时准备3个孔。
2) 按照下列体系制备2个质粒稀释液
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组1（阴性对照） |
组2（靶点一） |
组3（靶点二） |
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ptyne-53 0.4ug |
ptyne-53 0.4ug |
ptyne-53 0.4ug |
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pcas9/grna1空载体0.4ug |
pcas9/grna1-p531 0.4ug |
pcas9/grna1-p532 0.4ug |
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dmem培养基x ul |
dmem培养基 x ul |
dmem培养基 x ul |
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总体积50ul |
总体积50ul |
总体积50ul |
3) 准备转染试剂稀释液：
polyfect-v转染试剂 4.8ul
dmem培养基 145.2ul
4) 将质粒稀释液和转染试剂稀释液分别混匀。取50ul转染试剂稀释液分别加入两组质粒稀释液中，充分混匀，室温孵育15min。
5) 将转染液加入293t细胞。
6) 48小时后检测egfp荧光表达。
验证实验结果
图一：靶点效率检测。转染48小时候荧光照片。
检测结果显示靶点一和靶点二均有效果，靶点一的效果优于靶点二。
tp53基因敲除293t细胞筛选
实验步骤
1) 转染前24小时将293t铺到6孔板中。
2) 按照下列体系制备质粒稀释液
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pcas9/grna1-p531 0.7ug |
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plv-egfp（2a）puro 0.1ug |
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dmem培养基x ul |
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总体积50ul |
3) 准备转染试剂稀释液：
polyfect-v转染试剂 1.6ul
dmem培养基 48.4ul
4) 将质粒稀释液和转染试剂稀释液分别混匀。取50ul转染试剂稀释液分别加入两组质粒稀释液中，充分混匀，室温孵育15min。
5) 将转染液加入293t细胞。
6) 48小时后加入puromycin至终浓度为3ug/ml。
7）筛选3天后消化细胞，用有限稀释法将细胞接种到394孔板，标记单个细胞的孔，做单克隆细胞培养。培养时不加puromycin。
8）约7-10天，细胞形成克隆。消化细胞，将部分细胞继续培养，部分细胞提取基因组dna检测tp53基因敲除结果。
克隆检测结果
以细胞克隆提取出的基因组dna为模板，pcr扩增tp53第4外显子基因序列，并测序。
测序的20个克隆结果如下：
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单敲除细胞克隆 |
12个 |
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双敲除细胞克隆 |
2个 |
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未突变细胞克隆 |
6个 |
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合计 |
20个 |
测序结果截图：
用到的产品：
ptyne载体 货号：cr1011
pcas9/grna1载体 货号：cr1001