实验原理
ptyne载体在egfp编码框上游有2个错码的atg起始密码子，由于不能有效地启动egfp表达，ptyne转染细胞仅能发出很微弱的荧光。我们根据ptyne载体的序列设计了pcas9/grna1对照阳性质粒pcas9-p，该质粒上的grna与ptyne上egfp编码区上游结合。pcas9-p表达的cas9蛋白和grna组合现对ptyne载体切割，经细胞修复后，突变的ptyne将表达出读码框正确的egfp蛋白，发出明亮的绿色荧光。
pcas9/grna1阳性对照载体（pcas9-p）靶序列：cttcgaattctgcagtcga。该靶点位于ptyne egfp基因上游。
pcas9/grna1阴性对照载体（pcas9-n）靶序列：atcgactagccactcagac。该序列为随机序列。
pcas9-p靶点在ptyne载体上的位置:
cas9切割原理:
实验内容
1、实验材料
ptyne质粒（验证载体，无内毒素试剂盒制备；货号：cr1011）
pcas9 –n质粒（pcas9/grna1阴性对照，货号：cr1003，无内毒素试剂盒制备）
pcas9 –p质粒（pcas9/grna1阳性对照，货号：cr1002，无内毒素试剂盒制备）
polyfect-v转染试剂（货号：p2010-1）
293t细胞系
2、实验步骤
1) 转染前24小时将293t铺到24孔板中。同时准备2个孔。
2) 按照下列体系制备2个质粒稀释液
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组a |
组b |
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ptyne 0.4ug |
ptyne 0.4ug |
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pcas9 –n 0.4ug |
pcas9 –p 0.4ug |
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dmem培养基x ul |
dmem培养基 x ul |
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总体积50ul |
总体积50ul |
3) 准备转染试剂稀释液：
polyfect-v转染试剂 3.2ul
dmem培养基 96.8ul
4) 将质粒稀释液和转染试剂稀释液分别混匀。取50ul转染试剂稀释液分别加入两组质粒稀释液中，充分混匀，室温孵育15min。
5) 将转染液加入293t细胞。
6) 48小时后检测egfp荧光表达。
3、实验结果
