一、试剂
1. 细胞培养基及其他细胞培养所需试剂。
2. 转染辅助试剂polybrene（用水配制为6mg/ml，-20℃冻存）。
3. cas9表达慢病毒（制备方法见cas9慢病毒包装实验）。
4. 嘌呤霉素或者g418。
二、实验步骤
1、 转染前24小时将293t以适当密度铺板到12孔板。感染病毒时细胞密度在80%左右。
2、 取出制备好的cas9表达慢病毒（plv-cas9-puro包装得到，制备方法见cas9慢病毒包装实验），室温融化。按照下面的方法准备慢病毒感染液：
以感染1个12孔板细胞（细胞培养基体积1ml）为例
病毒液 50ul
细胞完全培养基到950ul
加入polybrene到终浓度为6ug/ml
3、 用病毒感染液替换原细胞培养基，继续培养24小时。用新鲜的培养基替换病毒感染液。
4、 病毒感染48小时后，转入的基因开始表达。这时可以加入嘌呤霉素至终浓度为3ug/ml。
5、 在筛选过程中为维持抗生素合适的浓度和细胞营养，每隔2-3天应该换液一次，去除死细胞，补加抗生素。
6、 大约6-7天，细胞不再死亡。扩大培养筛选得到的细胞，进行检测。
三、pcr检测细胞基因组中的cas9基因
用基因组pcr检测293t-cas9细胞中的cas9基因。
鉴定引物：
cas9-f：acagtcttcacgagcacatc
cas9-r：tcctcttcatcctttcccta
产物大小198bp
步骤：
1、 分别提取293t-cas9细胞和293t细胞的基因组dna。
2、 pcr扩增
反应体系：
2×taq mix 25ul
cas9-f（10um）2ul
cas9-r（10um）2ul
基因组模板 5ul
加水补足50ul
反应条件：95℃ 预变性5min；95℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 30sec，35个循环。
3、 电泳检测pcr产物
m：dl2000 dna marker
1：293t-cas9扩增产物
2：293t扩增产物
四、 相关实验
五、 相关产品