手性物质的分离分析方法有手性源合成法、结晶拆分法、化学拆分法、酶拆分法、膜拆分法、萃取拆分法和色谱拆分法等。
1、手性源合成法：
手性源合成法是以单一对映体的手性化合物为原料合成另外的手性化合物的单一对映体，这是化学家常用的方法。
由于原料的立体结构决定着产物的立体构型，获得制备所需对映体的手性原料是关键。但天然手性物质的品种和数量有限，满足不了实际需求。利用天然手性物质衍生出所需的手性化合物，反应步骤较多，难度较大。
2、结晶拆分法：
结晶拆分法是基于对映体与手性物质形成非对映体盐或共价衍生物，然后利用非对映体的性质差异进行分离（如分级结晶），再将衍生物还原为对映体。
结晶拆分法分为晶体机械拆分法和接种结晶拆分法。
晶体机械拆分法是将外消旋混合物从溶液中结晶析出，依据两种对映体结晶形态的差别，从结晶物中进行手工分离。这一方法耗时费力，仅能应用于实验室研究。
接种结晶拆分法是采用加入纯对映体之一的晶种，将附在播入的晶种上的同种对映体析出的分步结晶分离方式。
虽然结晶拆分法操作简单，但要耗费大量的时间、劳力和物力，而其实验与预期存在很大偏差，因此应用不广泛。
3、化学拆分法：
化学拆分法是通过化学反应的方法，即用手性试剂将外消旋体中的两种对映体转化为非对映异构体，然后利用非对映异构体之间物理化学性质的不同将二者拆分开。拆分成功的关键是选择合适的拆分剂，合适的拆分剂应该是能够与对映体生成非对映异构体，且溶解度差别较大，经拆分后，易再生为原来的对映体。
虽然这种方法一直被作为重要的拆分方法，但其局限性也很明显：
（1）拆分剂和溶剂的选择较为盲目。
（2）拆分的产率和产品的对映纯度不高。
（3）适用于手性拆分的对映体的类型不多。
4、酶拆分法：
酶对光学活性异构体有选择性地进行酶解作用，使外消旋体中一种光学异构体酶解较快，而另一种酶解较慢，或不发生酶解，在适当的条件下被保留而达到分离。
酶拆分的主要途径为主体选择性水解、酶化和转酶作用。
酶催化的副反应很少、产率高、反应的条件较为温和，酶无毒、易降解、不会造成环境污染。但该法仅能适用于酶促反应体系，酶制剂品种有限，酶易被破坏不稳定，制剂的价格较高，阻碍了其应用发展。
5、膜拆分法：
氨基酸的生物转移通常是由埋在生物膜中的载体蛋白来完成的，这种转移的对映体选择性非常高，膜拆分对映体正是这种生物过程的模拟。
液膜拆分法是将具有手性选择能力的载体溶解在某种液体溶剂中，通过与某个异构体特异性的结合，将其从上相转移到下相，从而实现对映体的分离。但是由于液膜稳定性较差，其工业应用一直受到很大的限制。
为了克服液膜的不稳定性，固膜得到了很大的发展。固膜拆分法是不同的对映体通过选择性扩散或吸附来完成跨膜过程。选择性扩散固膜一般不带特殊的手性拆分剂，形成选择性扩散的原因是一种异构体比另一种异构体在固膜中更容易扩散。选择性吸附固膜主要是利用嵌在聚合物母体中的手性拆分剂与对映体之间特殊的分子间作用来进行手性拆分，通常一种异构体被较多的选择性吸附在手性拆分剂上，而另一种异构体则较多的游离在聚合物母体之中。
由于选择性与透过通量之间成反比例关系，选择性扩散固膜的应用受到了限制，只有通过扩大膜面积或者增加平衡级数来弥补，这在实际应用中很不经济。而选择性吸附固膜可以在选择性和透过通量两方面同时提高，从而使其在手性拆分工业中的大规模应用成为可能。
6、萃取拆分法：
萃取拆分法是利用萃取剂与拆分物中两对映体的亲和作用力的差异或化学作用的差异来进行拆分的方法。目前有三种萃取拆分方法：亲和萃取拆分法、配位萃取拆分法和形成非对映立体异构体萃取拆分法。
萃取拆分法适用性强，效率高，成本低，可连续化操作，可以实现萃取拆分过程与外消旋化反应一体化。
在拆分过程中使没有应用价值的对映体能连续地转化成所需要的对映体，使外消旋化产生的所需对映体萃入萃取相，萃余相中富集的无应用价值的对映体进行外消旋化反应，从而克服了单纯外消旋过程的缺陷。
在拆分过程中所选择的萃取剂是具有手性的，萃取剂的选择是拆分关键。
7、色谱拆分法：
色谱法是最可靠和最常用的测定低含量对映体杂质的方法之一，且能够测定复杂基质中对映体纯度，同时，容易实现对映体的大规模制备。色谱技术已成为当前手性分离的主要工具，手性分离成为色谱科学的重要研究对象。
（1）薄层色谱法：
薄层色谱法是最简便的色谱技术之一，具有操作简便、设备简单、分析速度快、结果直观和能快速更换流动相等特点，已在化学、化工、生化、医药和卫生等各个领域广泛使用。
尽管手性固定相价格、紫外背景、显色剂等原因，使的目前能用于薄层色谱的手性载体和能被薄层色谱法分离的手性化合物很少，但它将会成为手性拆分的重要手段之一，在光学异构体的分离、分析和光学纯度的测定中发挥重要的作用。
（2）气相色谱法：
气相色谱法是对映体拆分的一个重要手段。目前气相色谱中用于分离对映体的固定相主要有三类：手性氨基酸衍生物、光学活性的金属配合物和环糊精手性固定相。
气相色谱法优点：流动相简单、分离度高和柱效高、适合拆分一些不带芳香环的对映体化合物（这类对映体在液相色谱条件下通常很难被分离和检测）。
气相色谱法缺点：一般要在较高的温度下进行，易导致手性选择剂的消旋化，降低其手性识别能力。可分离的对映体有限，一般只能分离易于汽化和热稳定性高的对映体化合物。
（3）毛细管电泳：
毛细管电泳具有简便、高效、试样用量少和和几乎没有废液的特点，作为一种简单快捷、经济方便的现代技术，在药物分析和临床医学研究中得到了越来越广泛的应用。
毛细管电泳法分离对映体时，一般是将手性选择剂添加到缓冲液中，对映体分子可与手性选择剂形成具有不同稳定性的复合物，导致迁移速度差异而进行分离。常用的方法有：毛细管区带电泳法、胶束电动色谱法和毛细管电色谱法。
（4）超临界流体色谱法：
超临界流体色谱法以超临界流体（如液体co2）为流动相对化合物进行分离。与气体流动相相比，超临界流体对样品的溶解度高。与常规的液体流动相相比，超临界流体粘度低，扩散系数大。
超临界流体色谱法优点：
1）具有分析速度快、柱效高等优点。
2）适合于热稳定性差和低挥发性物质的分析。
3）由于其具有很好的环境友好性，在药物及代谢产物、天然产物、油脂、食品、农业和环境样品分析等诸多领域发挥一定的作用。
超临界流体色谱法缺点：对仪器要求较高，普及性较差，这在一定程度上限制了其应用。
（5）高效液相色谱：
高效液相色谱手性固定相分离测定对映体速度快、柱效高、适用范围广（可以用于对热稳定性差和极性农药的分析）、分离能力强，是手性药物分离的首选技术平台之一。
高效液相色谱较气相色谱和电泳技术应用广泛的原因：
1）由于所有药物进入生物体都是由生物体的体液运输而进一步产生作用的，几乎所有手性药物都能在高效液相色谱方法中找到适合于其本身特点的分离环境。
2）高效液相色谱更易实现生物样品的在线预处理，能实现高度的自动化。